揮發(fā)性檔案防霉劑防霉效果測(cè)定方法
DA/T 26-2000
1范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了揮發(fā)性檔案防霉劑防霉效果測(cè)試材料、儀器設(shè)備、測(cè)試條件、測(cè)試方法、結(jié)果評(píng)定等內(nèi)容。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于揮發(fā)性檔案防霉劑防霉效果的測(cè)定。
2測(cè)試用品與設(shè)備
2.1用品
2.1.1培養(yǎng)基
2.1.2供試菌種
2.1.3受試底物
2.1.4醫(yī)用噴霧器
2.1.5醫(yī)用剪刀
2.1.6醫(yī)用紗布
2.1.7小試管(15mm×150mm)
2.1.8培養(yǎng)皿(90mm)
2.1.9移液管(吸管)(1mL)
2.1.10三角燒瓶(250mL、500mL)
2.1.11燒杯(250mL、500mL、1000mL)
2.1.12量筒(100mL、500mL、1000mL)
2.1.13帶蓋的圓柱形玻璃器皿(容積約為1200mL)
2.2設(shè)備
2.2.1手提醫(yī)用消毒器
2.2.2架盤天平
2.2.3電熱干燥箱
2.2.4恒溫恒濕培養(yǎng)箱
2.2.5電冰箱
2.2.6無菌操作臺(tái)或無菌室
3測(cè)試條件
3.1溫度28℃±2℃。
3.2濕度RH≥93%。
3.3培養(yǎng)基
土豆汁培養(yǎng)基(配方見附錄A)。
3.4菌種
雜色曲霉(Aspergillus Versicolor)
黑曲霉(Aspergillus niger)
產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)
桔青霉(Penicillium citrinum)
球毛殼霉(Chaetomium globasum)
臘葉芽枝霉(Cladosporium herbarum)
綠色木霉(Trichoderma viride)
宛氏擬青霉(Paecilomyces varioti)
3.5菌量(見附錄C)
混合孢子懸浮液濃度:1×105個(gè)/mL～1×107個(gè)/mL。
3.6底物
宣紙、卡紙、書寫紙、牛皮紙、漆紙、漆布(尺寸大小為20mm×30mm)，膠片、錄像帶(尺寸大小為自然寬度×30mm)。
3.7藥量
1000mL體積中懸掛1.0g(即1000mg)藥物。
3.8時(shí)間
放置28天。
4測(cè)試方法
4.1消毒器皿
先用清水中加入數(shù)滴洗滌劑的洗潔液浸洗圓柱玻璃器皿，再用清水沖洗，最后用75%乙醇涂擦消霉，待干，備用。
4.2準(zhǔn)備無菌水
準(zhǔn)備好帶玻璃珠的無菌生理鹽水和不帶玻璃珠的無菌水若干瓶。即在250mL三角瓶中注人100mL生理鹽水，并放人幾十粒玻璃珠，滅菌(參見附錄B)。在250mL三角瓶中注人200mL自來水，同樣滅菌。
4.3制備霉菌孢子懸浮液(見附錄D)
在無菌室或無菌操作臺(tái)，在火焰旁，用接種環(huán)分別挑取8株供試霉菌，接人帶上述玻璃珠的無菌生理鹽水中，用手振蕩3min～5min，使孢子充分分散，復(fù)制成1×105個(gè)/mL～1×107個(gè)/mL的霉菌孢子懸浮液，備用。
4.4放置樣品(見圖1)
4.4.1在適當(dāng)?shù)牟Ａ髅髢?nèi)，懸掛受試底物，并噴灑霉菌孢子懸浮液(以表面濕潤為宜)，晾干，備用。
4.4.2在圓柱形玻璃器皿底部倒人200mL左右的無菌水(其目的是保持濕度，同時(shí)占去多余容積，使玻璃器皿內(nèi)的空間容積正好為1000mL。
4.4.3將1.0g揮發(fā)性防霉劑用二層紗布或無紡布包裹后懸掛于玻璃器皿中央部位。
4.4.4在防霉劑周圍懸掛受試底物(間隔至少1cm，不能相互接觸)
4.4.5將玻璃器皿瓶口用蓋子蓋緊(或用透明復(fù)合塑料膜包扎)，保持密封。
4.4.6將玻璃器皿置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)，在28℃±2℃，RH≥95%條件下，培養(yǎng)28天。
4.5空白對(duì)照
在圓柱形玻璃器皿中央部位不懸掛揮發(fā)性防霉劑，重復(fù)上述步聚，作空白對(duì)照。
當(dāng)空白對(duì)照容器內(nèi)的受試底物發(fā)霉嚴(yán)重時(shí)(即長霉程度++～+++)，測(cè)試有效，否則必須重做。
5結(jié)果測(cè)定
用肉眼觀察長霉程度并進(jìn)行等級(jí)評(píng)定(見表1)。
表1：長霉程度和等級(jí)
| 菌絲生長情況 |
長霉程度 |
長霉等級(jí) |
| 試樣表面看不到菌絲生長 |
- |
0級(jí) |
| 試樣表面看到菌絲生長，但菌絲生長面積不超過全面積的三分之一 |
+ |
1級(jí) |
| 試樣表面看到菌絲生長，菌絲生長面積超過全面積的三分之一，但不超過全面積的三分之二 |
++ |
2級(jí) |
| 試樣表面看到菌絲生長，菌絲生長面積超過全面積的三分之二 |
+++ |
3級(jí) |
附錄A
(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)
培養(yǎng)基的配制與滅菌
A1培養(yǎng)基的配制
培養(yǎng)基從形式區(qū)分有固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基，從內(nèi)容區(qū)分有合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基等。其配制步聚為:
a)物料稱量
明確培養(yǎng)基的組成部分，根據(jù)需要配制的量計(jì)算好各成分的重量，逐一稱取。
b)溶解
一般情況下，可將幾種原料和藥品一起放大燒杯內(nèi)調(diào)勻，并定容到需要的體積。
c)調(diào)節(jié)pH
微生物生長需要合適的pH，通常用1mol/L(1N)NaOH，1mol/L(1N)HCl或0.5mol/L(1N)H2S04調(diào)節(jié)pH至5.0。調(diào)節(jié)時(shí)要慢慢滴入，不斷用pH試紙檢查，至所需要的pH為止。
d)加熱溶解
配制固體培養(yǎng)基一般加入2%的瓊脂(俗稱洋菜)，與培養(yǎng)基一起加熱溶解。加入瓊脂后，須不斷攪拌，以免瓊脂粘底燒焦。
e)過濾
一般來說，培養(yǎng)基配制好后要過濾，濾去不溶物或塊狀物。過濾必須趁熱進(jìn)行，通常用4～6層紗布作濾層。無不溶物或塊狀物的培養(yǎng)基也可以不過濾。
f)分裝
按照需要，分裝進(jìn)試管、培養(yǎng)皿或三角燒瓶中。一般只裝到試管的1/5，培養(yǎng)皿中裝入15mL～20mL，三角燒瓶裝入一半量。
g)加棉花塞或紗布、絨布扎口
培養(yǎng)基灌裝后，應(yīng)在試管口或三角燒瓶口上加棉花塞或紗布、絨布扎口，其作用有二:一是阻止外界微生物進(jìn)入，二是保證有良好的通氣，以便微生物能不斷獲得無菌空氣。
h)包扎
棉塞塞好后，試管扎成捆，同時(shí)在外面包扎上一層牛皮紙。三角燒瓶口也用牛皮紙包扎好，以防滅菌時(shí)冷凝水浸濕棉塞和滅菌后的灰塵侵入。
i)滅菌
一般情況下，培養(yǎng)基配制好后應(yīng)立即滅菌，于1kg/cm2壓力下消毒30min即可。如不及時(shí)滅菌，則應(yīng)放人冰箱內(nèi)保存。
滅菌時(shí)，必須先將壓力器內(nèi)的空氣排放干凈，否則，即使壓力到了所規(guī)定的數(shù)值，還是達(dá)不到所需要的溫度。
j)定形
固體培養(yǎng)基溫度降到一定程度時(shí)便凝固成形。
A2霉菌培養(yǎng)基配方
霉菌培養(yǎng)基配方有多種，本標(biāo)準(zhǔn)采用土豆汁培養(yǎng)基，配方如下:
土豆(去皮)200g、水1000mL、瓊脂20g、pH5。0
將土豆洗凈去皮，稱取200g，切成小塊，加1000mL水煮沸1h，用雙層紗布濾成清液。加水補(bǔ)充因蒸發(fā)而減少的水分。
附錄B
(提示的附錄)
玻璃器皿的清洗與滅菌
B1玻璃器皿的清洗
對(duì)買來的新試管、移液管、培養(yǎng)皿、三角燒杯、燒杯等玻璃器皿，先用水沖洗，然后放在5%的堿溶液內(nèi)洗刷，再放在3%的鹽酸溶液內(nèi)中和，最后用水沖洗，晾干或烘干即可。
培養(yǎng)或污染過微生物的玻璃器皿，在洗滌之前，必須先進(jìn)行消毒。一般采用高壓滅菌，也可用常壓煮沸或其他化學(xué)藥品消毒。消毒后，將臟的培養(yǎng)物或其他污染物去掉，然后用清水沖洗，再在肥皂水中洗刷，最后用清水沖洗干凈，晾干或烘干即可。
遇有不易洗刷干凈的玻璃器皿，則可用硫酸重鉻酸鉀洗液浸漬后再清洗。其配方是:粗硫酸900mL，重鉻酸鉀(粗制)100g，自來水100mL。配制順序是:先將自來水和重鉻酸鉀置于燒杯中，加熱溶化，待冷卻后，再以細(xì)流加入硫酸即可。
若玻璃器皿上有橡皮膠、封蠟、凡士林等物時(shí)，應(yīng)另外處理，然后再按上述清洗過程洗滌。
B2玻璃器皿的滅菌
微生物試驗(yàn)中所用的玻璃器皿都可以采用高壓滅菌。清洗干凈的玻璃器皿晾干或烘干后分別進(jìn)行封口、包扎，然后滅菌。
培養(yǎng)皿一般用牛皮紙包裹(10套一包)，用線扎牢，或裝入特制的鋁皮盒內(nèi)。試管應(yīng)先加棉花塞(采用脫脂棉)，棉塞的大小松緊要適宜，以便操作時(shí)易于拔取和塞回。最后裝進(jìn)試管筐內(nèi)，上面包以牛皮紙。吸管(移液管)管口應(yīng)先塞少許棉花，以免使用不慎將微生物吸入口中或橡皮吸球內(nèi)。然后每支吸管都先用薄紙包卷，每10支吸管用牛皮紙包扎好。三角燒瓶瓶口用絨布(或幾層紗布)及牛皮紙包扎好。其他玻璃器皿也都用牛皮紙包裹后再進(jìn)行滅菌。
準(zhǔn)備工作做好后，將玻璃器皿置高壓滅菌器內(nèi)，在1kg/cm2壓力下消毒45min即可。滅菌后，取出，烘干，備用。
試管、培養(yǎng)皿、三角燒瓶等玻璃器皿以及金屬用具也可施行干熱滅菌。先用水洗滌干凈，待干燥后塞上棉花或絨布，用牛皮紙包扎好，置電熱干燥箱內(nèi)，加熱至150℃～170℃，約保持1h～2h。
附錄C
(提示的附錄)
活菌計(jì)數(shù)
C1步聚
a)用滅菌吸管吸取1mL霉菌孢子懸浮液注入9mL滅菌生理鹽水試管中(注意勿使吸管接觸液體)，充分混勻，制成1：10稀釋菌液。
b)用滅菌吸管吸取1mL1：10的霉菌孢子稀釋液注入到另一支9mL滅菌生理鹽水試管中，充分混勻，使成1：100稀釋菌液。
c)根據(jù)霉菌孢子懸浮液的濃度，用同樣方法，制成1：1 000、1：10 000、1：100 000、1：1 000 000,1：10 000 000等稀釋菌液(每次稀釋應(yīng)更換一支來菌吸管)。
d)用滅菌吸管吸取上述稀釋液各1mL分別注入滅菌培養(yǎng)皿中，每種稀釋度應(yīng)做3～5塊培養(yǎng)皿。
e)將溶化并冷卻至45℃左右的霉菌瓊脂培養(yǎng)基放人各培養(yǎng)皿內(nèi)(每皿約15mL～20mL)，隨即晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使菌液與培養(yǎng)基充分混合，平放，待凝固。
f)將培養(yǎng)基凝固后的培養(yǎng)皿置于28℃±2℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3天，取出，觀察菌落并計(jì)數(shù)。
C2要求
操作必須在無菌室或無菌箱內(nèi)進(jìn)行。
C3計(jì)數(shù)
用肉眼觀察，點(diǎn)數(shù)菌落數(shù)。由于霉菌不同于細(xì)菌和酵母，其菌落大，且擴(kuò)展快，故計(jì)數(shù)時(shí)依每皿5～10個(gè)菌落為宜，少于或超過這一數(shù)字的培養(yǎng)皿可不作計(jì)數(shù)。每種稀釋度的3～5塊培養(yǎng)皿取其平均值。
應(yīng)使用下列公式:
式中
X=(S/N)?M(個(gè)/mL)
X––每毫升霉菌孢子懸浮液的活菌數(shù);
S––稀釋度培養(yǎng)皿上出現(xiàn)的菌落總數(shù);
N––培養(yǎng)皿的數(shù)目;
M––稀釋倍數(shù)。
示例:
1：10 000 000(即1×10-7)稀釋度5塊培養(yǎng)皿上出現(xiàn)的菌落數(shù)分別為6、10、7、9、8，則每毫升霉菌孢子懸浮液的活菌數(shù)為:
X=〔(6+10+7+9+8)/5〕×10000000=80000000個(gè)/mL，即8×107個(gè)/mL
附錄D
(提示的附錄)
菌株接種與保藏
D1接種
菌株接種常用接種環(huán)或接種針。接種過程必須執(zhí)行嚴(yán)格的無菌操作，通常在無菌室或無菌操作臺(tái)上進(jìn)行，并靠近火焰(煤氣燈或酒精燈)操作。
斜面接種是從已生長好的菌種斜面上用接種環(huán)(或針)挑取少許菌落，把它們移接到另一支新鮮斜面培養(yǎng)基上。具體步聚是:
手持試管斜面→旋松棉塞→取接種環(huán)→拔棉花塞→環(huán)灼燒冷卻→挑取菌種→接種→塞棉花塞→接種環(huán)滅菌。
將接種過的斜面培養(yǎng)基置于28℃±2℃恒溫中培養(yǎng)，3～5天后取出。
D2保藏
菌種保藏方法有多種，常用的是斜面菌種保藏法。
霉菌一般保藏在土豆瓊脂斜面或察氏瓊脂斜面。通常存放于2℃～4℃的冰箱或冰庫中，用此法可保存3個(gè)月，即3個(gè)月以后必須重新移植一次。
